تعیین فعالیت آنزیم دیاستاز عسل (روش کیفی)
محلول ید : يك گرم يد و دو گرم يدور پتاسيم را در 300 ميلي ليترآب مقطر حل كنيد.
محلول نشاسته یک در صد: یک گرم نشاسته را در مقداری آب مقطر با کمی جوشاندن حل کنید و به حجم 100 برسانید این محلول را تازه تهیه و مصرف کنید.
روش کار:
ا ز نمونه آماده شده عسل، يك قسمت را در دو قسمت آب مقطر حل كنيد در دو بشر كوچك يا لوله آزمايش هر يك 10 ميلي ليتر ازاين محلول بريزيد و به يكي از لوله ها (لوله نمونه) يك ميلي ليتر محلول نشاسته يك درصد بريزيد و آن را در بن ماري يا آون با دماي 45 درجه سلسيوس به مدت يك ساعت بگذاريد سپس به آن يك ميلي ليتر محلول يد اضافه كنيدورنگ حاصل را مشاهده نماييد. بلا فاصله به لوله دوم (شاهد) يك ميلي ليتر محلول نشاسته و يك ميلي ليتر يد اضافه كنيد و رنگ حاصل را با رنگ لوله نمونه مقايسه كنيد .
اگر عسل داراي فعاليت دياستازي باشد رنگ سبز زيتوني يا قهوه اي درمخلوط ظاهر مي شود اگر عسل را زياد حرارت داده باشند و يا طبيعي نباشد رنگ آبي حاصل مي شود .
تعیین فعالیت دیاستاز عسل (روش کمی)
تعریف : واحد فعالیت دیاستاز گوته می باشد و آن مقدار آنزیمی است که 0.01 گرم نشاسته را در مدت یک ساعت و در دمای 40 درجه سلسیوس تحت شرایط آزمون هیدرولیز نماید. نتایج بر حسب واحد گوته یا شید در یک گرم عسل بیان می گردد.
اصول روش :
یک محلول استاندارد نشاسته که قابلیت ارزیابی با ید را دارد، به نمونه عسل اضافه می شود، آنزیم های موجود در نمونه تحت شرایط استاندارد موجب هیدرولیز نشاسته می شود و تغییر رنگ حاصل به عنوان دامنه شناسایی شدت واکنش بکار می رود. در این تبدیل کاهش رنگ آبی در فواصل زمانی معین اندازه گیری می شود. برای تعیین (tx) که برای رسیدن به جذب مخصوص 0.235 نیاز است یک نمودار جذب بر حسب زمان یا یک معادله رگراسیون به کار برود. عدد دیاستاز از تقسیم 300 بر tx حاصل می شود.
- محلول NaCl : 2.9 گرم NaCl را در آب حل کنید و به حجم 100 برسانید.
- محلول بافر استات (PH = 5.3)
43.5 گرم سدیم استات 3 آبه را در آب حل کنید و PH آن را با حدود 5 میلی لیتر اسید استیک گلاسیال تا 5.3 تنظیم و تا حجم 250 میلی لیتر رقیق کنید.
تعیین وزن خشک نشاسته
حدود 2 گرم نشاسته محلولی را که در هوا خشک شده روی کف ظرف دار تعیین رطوبت (قطر 5 سانتی متر) بصورت لایه نازکی با یک میله پخش کنید و با دقت 0.1 میلی گرم آنرا وزن و در دمای 130 درجه بمدت 90 دقیقه آنرا خشک کنید. و در دسیکاتور خنک کرده و دوباره وزن کنید.
آماده سازی محلول نشاسته
در ارلن 250 ميلي ليتري معادل 2 گرم نشاسته بدون آب خشك شده را وزن كنيد. با 90 ميلي ليتر آب آنرا مخلوط كنيد. بسرعت آنرا بجوش آوريد و به هم بزنيد و به مدت 3 دقيقه به آرامي بجوشانيد .فورا محلول داغ را به بالن ژوژه 100 انتقال دهيد و به سرعت زير شير آب سرد كنيد. سپس به حجم 100 برسانيد. و به هم بزنيد تا يكنواخت شود.
یادآوری : محلول نشاسته را در روز مصرف تازه تهیه کنید. فقط از نشاسته قابل حلی که محلول آبی رنگ شفاف می دهد استفاده کنید.
محلول ید ذخیره :
11 گرم ید دوبار تصفیه شده و 22 گرم پتاسیم یدید را در 30 تا 40 میلی لیتر آب حل و به حجم 500 میلی لیتر برسانید. محلول ذخیره در فضای بسته و ظرف تیره تا یکسال قابل نگهداری است.
محلول ید رقیق شده : 20 گرم KI را در آب حل و 2 میلی لیتر از محلول ید ذخیره به ان اضافه کنید و به حجم 500 میلی لیتر برسانید. محلول ید رقیق باید در روز مصرف تازه تهیه شود. و از مجاورت با هوا تا حد امکان محافظت شود در آن را پس از مصرف فورا ببندید.
آماده سازی نمونه عسل (II) :
10 گرم از نمونه عسل آماده شده را بدون گرم کردن در بشر کوچکی وزن کنید و با حدود 15 میلی لیتر آب کاملا حل و 5 میلی لیتر بافر استات به آن اضافه کنید. محلول را بطور کامل به بالن حجمی 50 میلی لیتری که دارای 3 میلی لیتر محلول NaCl است انتقال دهید و تا خط نشانه پر کنید.
یادآوری: به محلول عسل قبل از تماس با NaCl بافر اضافه شده باشد چون در PH کمتر از 4 دیاستازی را کاهش می دهد.
استاندارد کردن محلول نشاسته (تنظیم عدد آبی)
این روش برای تعیین حجم آبی که باید به مخلوط واکنش اضافه شود انجام می گیرد، بطوریکه دامنه جذب محلول نشاسته – ید از 0.745 تا 0.770 شود. در شش لوله آزمایش به ترتیب 20 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، 25 میلی لیتر آب و 5 میلی لیتر محلول رقیق ید بریزید.
به لوله آزمایش اول 0.5 میلی لیتر از مخلوطی که دارای 10 میلی لیتر آب و 5 میلی لیتر محلول نشاسته است اضافه کنید، بخوبی بهم بزنید و فورا جذب را در 660 نانومتر در برابر شاهد آب مقطر در سل یک سانتی مترب بخوانید. به همین ترتیب در مورد لوله های آزمایش دیگر ادامه دهید. تا حذب در محدوده 0.770 تا 0.745 بدست آید. مقدار آبی که از این را تعیین می شود رقت استاندارد برای مخلوط کردن با نشاسته می باشد.
یادآوری : در کالیبراسیون و همچنین تعیین فعالیت دیاستازی باید لحظه اضافه کردن محلول رقیق شده نشاسته تا تعیین جذب تا حد امکان زمانی ثابت باشد. اگر جذبی کمتر از 0.745 در مرحله اول رقت (20 میلی لیتر) و یا جذب بالاتر از 0.770 در آخرین رقت ( 25 میلی لیتر) بدست آید نشاسته برای این روش تعیین فعالیت دیاستازی مناسب نیست.
تعیین فعالیت دیاستاز عسل نمونه
10 میلی لیتر محلول نمونه عسل آماده شده (II) را با پی پت در بالن 50 میلی لیتری بریزید. در یک بالن دیگر 10 میلی لیتر محلول نشاسته بریزید. و هر دو را در حمام آب 40 درجه سلسیوس قرار دهید. بعد از 15 دقیقه 5 میلی لیتر محلول نشاسته را به داخل محلول عسل اضافه و مخلوط کنید. زمان را شروع کنید در فواصل زمانی، پس از 5 دقیقه اول 0.5 میلی لیتر از آن را به سرعت به 5 میلی لیتر از محلول ید رقیق اضافه کنید و به آن مقدار آبی که در استاندارد کردن محلول نشاسته تعیین شد را بیافزایید و به خوبی مخلوط کنید و به طور جداگانه جذب هر یک از محلول ها را در 660 نانومتر همراه با شاهد آب مقطر در سل یک سانتی متری بخوانید.
فواصل زمانی را بعد از اولین برداشت از بالن محتوی واکنشگر باید طوری تنظیم کرد که 3 تا 4 رقم در محدوده جذب 0.456 – 0.155 بدست آید (دامنه خطی)
فواصل زمانی برای خواندن جذب فعالیت دیاستاز عسل
جذب در مدت زمان 5 دقیقه فاصله زمانی
جذب بیشتر از 0.658 10 دقیقه یا بیشتر
جذب کمتر از 0.658 و بیشتر از 0.523 5 تا 10 دقیقه
جذب کمتر از 0.523 و بیشتر از 0.456 2 تا 5 دقیقه
اگر جذب در زمان 5 دقیقه کمتر از 0.35 است باید زمان واکنش برای اولین اندازه گیری بطور مناسب کاهش داده شود.
واکنش شاهد
10 میلی لیتر از محلول نمونه آماده سازی شده را به 5 میلی لیتر آب اضافه و مخلوط کنید. 0.5 میلی لیتر از این محلول را بردارید و به 5 میلی لیتر ید رقیق شده اضافه کنید. مقدار آب تعیین شده برای استاندارد کردن محلول نشاسته را اضافه کنید. خوب مخلوط کنید و جذب را در 660 نانومتر و شاهد آب مقطر در سل یک سانتی متری بخوانید. اگر شاهد جذبی را نشان دهد آن را از مقادیر بدست آمده کسر کنید.
روش محاسبه و بیان نتایج دیاستاز عسل
فعالیت دیاستازی بر حسب عدد دیاستاز (DN) به شرح زیر است.
tx = زمان واکنش بر حسب دقیقه که به شرح زیر است.
در صورت لزوم نمودار جذب محلول های نمونه را در برابر زمان های واکنش بعد از تفریق جذب شاهد از جذب نمونه ، بر روی کاغذ میلی متری رسم کنید. برای تعیین زمان tx برای جذب 0.235 از میان نقاط اندازه گیری در دامنه جذب 0.155 تا 0.456 خط مستقیمی کشیده می شود. حداقل 3 نقطه در این دامنه جذب باید تعیین گردد. زمان برای جذب A=0.235می تواند از معادله رگراسیونی محاسبه شود. که این روش معمولا به روش ترسیمی ترجیح داده می شود.
محاسبه نیم عمر آنزیم دیاستاز با دماهای مختلف نگهداری عسل
Tosi, E., Martinet, R., Ortega, M., Lucero, H. A., & Ré, E. (2008). Honey diastase activity modified by heating. Food chemistry, 106(3), 883-887
https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2007.04.025
Bogdanov, S., Lüllmann, C., Martin, P., Von Der Ohe, W., Russmann, H., Vorwohl, G., … & Vit, P. (1999). Honey quality and international regulatory standards: review by the International Honey Commission. Bee world, 80(2), 61-69
https://doi.org/10.1080/0005772X.1999.11099428
Sakač, N., & Sak-Bosnar, M. (2012). A rapid method for the determination of honey diastase activity. Talanta, 93, 135-138
https://doi.org/10.1016/j.talanta.2012.01.063
White, J. W. (1994). The role of HMF and diastase assays in honey quality evaluation. Bee world, 75(3), 104-117
https://doi.org/10.1080/0005772X.1994.11099213
Thrasyvoulou, A., Tananaki, C., Goras, G., Karazafiris, E., Dimou, M., Liolios, V., … & Gounari, S. (2018). Legislation of honey criteria and standards. Journal of Apicultural Research, 57(1), 88-96
